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    【和泰纯水知识集锦】第10期-内毒素的检测及去除方法
     
    热原(pyrogen)是微生物产生的内毒素,是由磷脂、脂多糖和蛋白质组成的复合物,微量即可引起恒温动物体温异常升高。其中脂多糖具有很强的热原活性。由革兰氏阴性杆菌产生的热原致热能力最强,真菌、病毒也可以产生热原。
    一、热原的性质及除去热原的方法:
    1.高温法
    热原的耐热性能良好,60℃加热1h不被分解破坏,100℃不降解,但180℃3~4h、200℃60min或250℃30~45min可使热原彻底破坏。因此耐热物品如玻璃制品、金属制品、生产过程中所用的容器和其它用具以及注射时使用的注射器等,均可采用此法破坏热原。但在通常使用的注射剂热压灭菌条件下不足以破坏热原。
    2.吸附法
    热原在水溶液中可被活性炭、石棉、白陶土等吸附而除去。由于活性炭性质稳定、吸附性强兼具助滤和脱色作用,故广泛用于注射剂生产,但应注意吸附药液所造成的主药的损失。
    3.超滤法
    热原分子量为1×106左右,体积较小,约1~5nm,可以通过一般滤器和微孔滤膜,但采用超滤法如用3.0~15nm超滤膜可将其除去。
    4.蒸馏法
    热原能溶于水但不挥发,但可随水蒸气的雾滴进入注射用水中,因此制备注射用水时,原水中的热原可经蒸馏除去,但需多次蒸馏,并加有隔沫装置,单次蒸馏往往效果不理想。
    5.酸碱法
    热原能被强酸、强碱、强氧化剂破坏。玻璃容器及用具如配液用玻璃器皿、输液瓶等可用重铬酸钾硫酸清洁液或稀氢氧化钠处理,破坏热原。
    6.其它
    包括离子交换法、凝胶滤过法、反渗透法等。
    二、热原的检查方法
    《中国药典》2005年版规定热原检查采用家兔法,细菌内毒素检查采用鲎试剂法。
    1.热原检查法
    由于家兔对热原的反应与人基本相似,目前家兔法仍为各国药典规定的检查热原的法定方法。
    《中国药典》2005年版规定的热原检查法系将一定剂量的供试品,静脉注入家兔体内,在规定时间内,观察家兔体温升高的情况,以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。检查结果的准确性和一致性取决于试验动物的状况、试验室条件和操作的规范性。家兔法检测内毒素的灵敏度为0.001μg/ml,试验结果接近人体真实情况,但操作繁琐费时,不能用于注射剂生产过程中的质量监控,且不适用于放射性药物、肿瘤抑制剂等细胞毒性药物制剂。
    2.细菌内毒素检查法
    细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素,以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。
    细菌内毒素检查包括凝胶法和光度测定法两种方法,前者利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素,后者包括浊度法和显色基质法,系分别利用鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化及产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少来测定内毒素。
    鲎试剂法检查内毒素的灵敏度为0.0001μg/ml,比家兔法灵敏10倍,操作简单易行,试验费用低,结果迅速可靠,适用于注射剂生产过程中的热原控制和家兔法不能检测的某些细胞毒性药物制剂,但其对革兰阴性菌以外的内毒素不灵敏,目前尚不能完全代替家兔法。
    Tips
    1.体积。细菌内毒素的大小、形态、化学组成因菌种不同而不同,细菌内毒素要比细菌小得多,直径仅1~50nm,类脂A更小,分子量只有几千,所以一般的过滤方法不易祛除,因其体小、质轻,有时甚至在蒸馏时会随水蒸气的雾滴逸出到蒸馏水中。
    2.热稳定性强:细菌内毒素耐热性很好,100℃以下无大变化,在120℃高温下加热4小时仅能破坏98%,要完全灭活需在180℃高温下,加热2小时以上,这样的祛除方法实施起来有相当难度。
    3.化学稳定性强: 一般化学药品不影响细菌内毒
    因细菌内毒素体积小,耐热性及化学稳定性强,所以一般的过滤、加热和化学方法不易去除或灭活?赡艹晌妇躺麓驳幕钚蕴嘉椒袄胱咏换皇髦椒, 也不甚理想。
    目前,行之有效的方法:膜分离技术,因具有分离精度高(可完成纳米级分离)、分离速度快、占地面积小、能耗低、使用寿命长等诸多长处,被广泛采用。比较典型的为超滤或反渗透法。超滤膜孔径(5~100nm)的下限与细菌内毒素相近,所以用小孔径的超滤膜去除细菌内毒素很可靠,其设备造价也比反渗透低的多。
    目前,截留分子量在6000左右的国产PS聚砜超滤膜,即可去除细菌内毒素,达到药典规定的指标(<0.25Eu/ml),在医用纯水、制药等行业中已获得成功应用。
    和泰实验室纯水系统的全系列除热源型超纯水机,采用PES聚醚砜,截留分子量达5000道尔顿的原装进口超滤膜组件,可以实现去除内毒素达到0.001Eu/ml的指标,远超药典规定的指标(<0.25Eu/ml),完全满足精密的细胞培养和IVF等实验对内毒素的要求。
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     2019-1-14 
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